A destilação é responsável por transformar a forma do nitrogênio, permitindo a sua quantificação na etapa posterior, que é a titulação. Uma série de detalhes garantem que a destilação seja realizada de maneira correta, influenciando nos resultados finais.

A destilação é a segunda etapa da análise de proteína pelo método Kjeldahl, e ocorre após a digestão da amostra. Saiba mais sobre as 8 dúvidas clássicas sobre a digestão na análise de proteína.

O método de determinação de nitrogênio total foi desenvolvido há mais de 130 anos pelo químico dinamarquês Johan Gustav Kjeldahl, e desde então, tem sido estudado, modificado e melhorado. O método Kjeldahl é referência ou padrão para quantificar o teor de proteína em alimentos, sendo recomendado por órgãos normalizadores como AOAC e ISO.  Esse método quantifica o teor de nitrogênio total e estima indiretamente o teor de proteína dos alimentos.

Método Kjeldahl

O método consiste na digestão com ácido sulfúrico concentrado e uma mistura catalítica para acelerar a reação, seguida de destilação com hidróxido de sódio para liberação do íon amônio que é retido (geralmente) em ácido bórico.

A última etapa é a titulação com ácido forte padronizado para quantificação do nitrogênio total presente na amostra. O teor de proteína é então estimado indiretamente através de cálculo, multiplicando o teor de nitrogênio por um fator de conversão.

O resultado final da análise, ou seja, o teor de proteína, é dependente da qualidade de cada etapa do processo analítico. Por possuir várias etapas, todos os detalhes do processo devem ser realizados de forma criteriosa com o intuito de se evitar erros.

Destilação

Na destilação o objetivo é transformar o nitrogênio presente na solução na forma de (NH₄)₂SO₄ (Sulfato de amônio, estável em meio líquido) para NH₄OH (Hidróxido de amônio, volátil). Com adição de Hidróxido de sódio (NaOH) concentrado e com o aquecimento, ocorre a liberação do íon amônio que é separado da mistura por destilação. O NH₄ liberado é aprisionado em uma solução de Ácido bórico, formando Borato de amônio, que é então titulado com ácido padronizado para cálculo do conteúdo de nitrogênio.

Em resumo, o tubo de borossilicato contendo a amostra digerida é colocado no Destilador de nitrogênio, modelo TE-0364, TE-0365/1 ou TE-0366, onde é dosado hidróxido de sódio para neutralização. O Sulfato de amônio, presente no tubo, em contato com o Hidróxido de sódio e o vapor de água da caldeira do equipamento, é transformado em Hidróxido de amônio e, assim, liberado em estado gasoso.

Quando o Hidróxido de amônio é liberado, ele passa pelo sistema de destilação do equipamento e condensa dentro do Erlenmeyer que foi preparado previamente com ácido bórico e indicador, formando o borato de amônio em uma coloração que passa de vermelho pálido para verde ou azul, a depender do indicador utilizado.

ü    Antes de iniciar a destilação

- A solução digerida deve estar resfriada em temperatura ambiente

- É necessário colocar um Erlenmeyer contendo Ácido bórico e indicador na saída do condensador, de forma que a ponteira do condensador fique mergulhada na solução no interior do erlenmeyer

ü    Qual a quantidade e por que é adicionada água na solução antes da destilação?

A diluição em água atenua reações violentas durante a alcalinização com Hidróxido de sódio. Dessa forma, com auxílio de uma pisseta é adicionada água destilada, de forma a lavar as paredes do tubo contendo a amostra. Em destiladores mais tradicionais (que não trabalham com caldeira geradora de vapor), a água também serve para promover a ebulição, função que deixa de ter sentido em destiladores com caldeira geradora de vapor.

A quantidade de água adicionada é relativamente pequena e se deve levar em conta o volume do tubo disponível. Se for adicionada água em excesso, superior a capacidade útil do tubo for, amostra pode subir para as esferas de Kjeldahl durante a destilação.

ü    Qual o volume de hidróxido de sódio?

Esse volume depende do quão acidificada está a solução e deve ser suficiente para sua neutralização e para completar a reação que transforma o Sulfato de amônio em Hidróxido de amônio. Por isso algumas vezes se faz uso de um indicador ácido-base, como fenolftaleína, para ajudar a definir o volume correto a ser adicionado.

Previamente ao Hidróxido de sódio, é adicionado 1 mL de solução de Fenolftaleína 1% à amostra. O volume de Hidróxido de sódio é adicionado lentamente, até que ocorra uma mudança de cor da solução seja visível.

ü    Qual volume de solução para iniciar a destilação?

O volume depende da capacidade do tubo utilizado e protocolo seguido. Se o volume de solução for superior a capacidade do mesmo, a solução pode subir para as esferas de Kjeldahl durante a destilação.

Os volumes recomendados para destilação são de até 30 ml no tubo micro e até 150 ml no tubo macro. 

ü    Qual volume coletado após a destilação?

O volume de destilado coletado deve ser padronizado para todas as amostras de acordo com o protocolo seguido.

Se houver um tempo maior de destilação, o volume coletado será superior, pois um maior volume de água será transportado para a solução receptora. Entretanto, o excesso de água não vai alterar os resultados da fase posterior, que é a titulação.

A maior parte de NH₃ destilada é retida na solução ácida receptora em um intervalo de 5 a 10 minutos do tempo de fervura. No entanto, dependendo do volume da mistura de digestão e do método a ser seguido, 15 a 150 ml de condensado devem ser coletados no frasco receptor para garantir a recuperação completa do nitrogênio.

ü    Taxa de destilação

 A taxa de destilação é afetada pela capacidade de resfriamento do condensador e pela temperatura da água de resfriamento, mas principalmente pela entrada de calor.

Uma taxa de destilação de cerca de 7,5 ml / minuto é mais comumente citada nos métodos aceitos.

ü    Amostras com baixo teor de nitrogênio

Para amostras com baixo teor de nitrogênio, além do maior volume de amostra, é indicado “pré-condicionar” o destilador de nitrogênio, antes da utilização.

Para isso é necessário destilar uma mistura 1:1 de água livre de amônia e 50% NaOH (hidróxido de sódio) por 5 minutos antes da destilação da amostra, para reduzir a contaminação da amônia atmosférica.

ü    Porque é importante o resfriamento do condensador?

O resfriamento do condensador é fundamental para a destilação além de garantir que o Tetraborato de amônio seja formado e não haja perda de amônia por evaporação, interferindo no resultado final.

O banho termostatizado pode ser utilizado para garantir o resfriamento dos condensadores, além disso, seu uso reduz o consumo de água, por ser um sistema de circulação fechada.  Para os destiladores de nitrogênio, modelo TE-0364 e TE-0365/1 podem ser utilizados os banhos termostatizados, modelo TE-183 e TE-184/1. Para o Destilador de Nitrogênio, modelo TE-0364, também pode ser utilizado o TE-2005/1.

ü    Finalizando a destilação

Ao finalizar a digestão, antes de desligar o destilador, o Erlenmeyer (localizado na ponta do condensador) deve ser retirado, para que não haja ter retorno da solução destilada para o equipamento.

Além disso, entre uma amostra e outra é necessário lavar a ponta do destilador com água destilada.

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Considerações finais

O método Kjeldahl é o mais utilizado para análise de proteína em alimentos, entretanto, é a ocorrência de erros acumulativos nas diferentes etapas analíticas (amostragem, digestão, destilação e titulação), pode comprometer a precisão e exatidão do resultado final.

Além de equipamentos adequados e definição do método a ser seguido, é necessário que os analistas estejam qualificados para estabelecer e conduzir o protocolo, garantido que o processo de análise seja realizado com sucesso.

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