A digestão é a primeira etapa da análise de proteína pelo método Kjeldahl, e ocorre após a amostragem e preparo da amostra.

 

O método de determinação de nitrogênio total foi desenvolvido há mais de 130 anos pelo dinamarquês Johan Gustav Kjeldahl, e desde então, tem sido estudado, modificado e melhorado. O método Kjeldahl é referência ou padrão para quantificar o teor de proteína em alimentos, sendo recomendado por órgãos normalizadores como AOAC e ISO.  Esse método quantifica o teor de nitrogênio total e estima indiretamente o teor de proteína dos alimentos.

 

 

Método Kjeldahl

 

O método consiste na digestão com ácido sulfúrico concentrado e uma mistura catalítica para acelerar a reação, seguida de destilação com hidróxido de sódio para liberação do íon amônio que é retido em ácido bórico.

 

A última etapa é a titulação com ácido forte padronizado para quantificação do nitrogênio total presente na amostra. O teor de proteína é então estimado indiretamente através de cálculo, multiplicando o teor de nitrogênio por um fator de conversão.

 

O resultado final da análise, ou seja, o teor de proteína, é dependente da qualidade de cada etapa do processo analítico.

Digestão

A digestão baseia-se no aquecimento da amostra com ácido sulfúrico até que os compostos orgânicos sejam oxidados. O nitrogênio da amostra (orgânico) é reduzido e transformado em sulfato de amônio (inorgânico) que é uma substância estável. Nessa etapa utiliza-se uma mistura catalítica com a finalidade de elevar temperatura de ebulição do ácido e aumentar a velocidade de oxidação da matéria orgânica, encurtando o tempo necessário para a digestão. 

A temperatura de ebulição do ácido sulfúrico concentrado é de cerca de 330 °C, e com a adição de um sal como sulfato de potássio (K₂SO₄), por exemplo, a temperatura da solução de digestão pode ser elevada a 390 °C ou mais, dependendo da proporção de sal para ácido.

 

Durante a digestão, o carbono é transformado em dióxido de carbono (CO₂) e o hidrogênio em água (H₂O). Além disso, o nitrogênio que existe sob a forma de amina, amida e nitrila é transformado em amônia (NH₃) a qual reage com o H₂SO₄, formando o sulfato de amônio ((NH₄)₂SO₄) durante a digestão – conforme mostrado nas reações abaixo, e esse ao se resfriar pode formar cristais (GALVANI, GAERTNER, 2006).  

Embora todas as etapas sejam críticas para o resultado final da análise, a digestão é umas das que mais geram dúvidas quanto a sua execução. Pensando facilitar e solucionar os questionamentos, elaboramos uma relação das perguntas mais frequentes.

 

1)  A digestão precisa ser realizada em capela de exaustão de gases?

Sim, o bloco deve ser instalado dentro da capela. A função primária da capela de exaustão é exaurir vapores e gases e funcionar como uma barreira física, oferecendo proteção aos usuários contra o derramamento de solução, quebra de vidraria, manipulação de reagentes e demais problemas que possam ocorrer durante a digestão ácida.

 

2)  É necessário o uso do Scrubber seco, modelo TE-154/1, mesmo quando a digestão é realizada no interior da capela de exaustão de gases?

Conforme resposta anterior, a capela é responsável por exaurir os vapores e gases tóxicos, entretanto, somente a capela, sem a presença de um sistema complementar, não faz nenhum tipo de neutralização ou tratamento dos gases tóxicos.

 

O Scrubber Seco garante o correto tratamento dos gases e vapores lançados a atmosfera, contribuindo para maior proteção ao meio ambiente, ao minimizar os impactos negativos.

3)  Qual volume de tubo utilizar?

O método é usualmente classificado em macro, semi-micro ou semi-macro e micro, conforme a quantidade de amostra submetida à digestão para análise. Os parâmetros que diferem um do outro são: massa de amostra (variando de miligramas a gramas ou ml), volume de ácido sulfúrico, tamanho das vidrarias utilizadas e equipamentos de digestão.

 

Embora a classificação do método irá depender da normativa ou diretriz adotada, é possível considerar a seguinte definição em relação ao tamanho da vidraria:

 

· Micro:  tubos com capacidade TOTAL para até 100ml​, equivalente ao Bloco digestor micro com rampas e patamares, modelo TE-041/25, não recomendado para amostras líquidas. 

· Semi Micro ou Semi Macro:  tubos com capacidade TOTAL para aproximadamente 400ml, equivalente ao Bloco digestor macro com touch screen, modelo TE-0081/50. Pode ser utilizado para amostras líquidas e sólidas. 

· Macro: tradicional digestor da técnica desenvolvida por Johan Gustav Kjeldahl, composto por balões com capacidade TOTAL entre 500ml e 800ml​. Pode ser utilizado para amostras líquidas e sólidas.

 

O fator determinante na escolha do método de Kjeldahl é o teor de nitrogênio na amostra. Somado a isso, o estado físico da amostra (líquida ou sólida), também influencia na escolha do protocolo.  Cabe salientar que a quantidade de amostra a ser analisada depende do teor de nitrogênio esperado e do grau de homogeneidade do material.

 

  Quanto maior o teor de nitrogênio da amostra, menor a massa de amostra requerida e consequentemente, menor é o tamanho do tubo. Abaixo uma sugestão para escolha do método ou tamanho do bloco/tubo de digestão: 

*amostra + reagentes

  

4)  Como calcular a massa de amostra correta?

O teor de nitrogênio ideal varia de 1 a 200 mg de nitrogênio por tubo de ensaio de vidro. O limite de determinação é 0,02 mg de nitrogênio por tubo de ensaio. Com base nesse dado pode-se calcular a correta massa de amostra a ser digerida.

 

5)  Qual a temperatura de aquecimento para digestão?

A temperatura ideal para digestão é definida em função do tipo de amostra e protocolo adotado. Entretanto, é recomendável que ela não ultrapasse de 430 °C. Uma faixa de 370°C a 400 °C, costuma atender os diferentes tipos de alimentos.

As temperaturas superiores a 390°C, a formação de gás nitrogénio (N₂) torna-se uma possibilidade, por favorecer a perda de nitrogênio por pirólise. Tal condição pode afetar a precisão do resultado final, por reduzir os teores de nitrogênio na amostra.

 

A perda de nitrogênio por volatilização é uma das razões do aquecimento ser gradual e não de maneira brusca.  

 

No início da digestão reação pode ser um pouco lenta, sendo esperada uma temperatura mais elevada no final do processo de digestão, em função do consumo gradual do ácido. Contudo, fatores como a entrada de calor, o consumo de ácido pelo material orgânico e a vaporização, a relação sal / ácido, o tempo de digestão e o tipo do frasco Kjeldahl, estão todos interrelacionados e influenciam na temperatura final da solução.

 

6)  Volume de ácido sulfúrico utilizado?

A quantidade de ácido necessária é influenciada pelo tamanho da amostra e quantidade relativa de carbono e hidrogênio na amostra, bem como a quantidade de nitrogênio. Além disso, uma amostra muito rica em gordura consome uma quantidade maior de ácido.

 

Portanto, a quantidade de ácido a ser inicialmente adicionada deve ser suficiente para a digestão da amostra sem esses interferentes e deve ser incrementada à medida que a massa de amostra e/ou interferentes aumentam.

 

Vale salientar que os incrementos no volume de ácido estão previstos nos protocolos, uma vez que estes já foram validados para os tipos de amostras aos quais se destinam.

 

7)  Qual a proporção ideal de ácido sulfúrico e catalisador?

A relação entre o ácido sulfúrico e os sais de sulfato é crucial para a ebulição temperatura a ser atingida. A relação ideal de ácido sulfúrico e catalisador é de aproximadamente 2 mL de H2SO4 por 1 g de catalisador

 

8)  Quando finaliza a digestão?

O processo de digestão está finalizado quando ocorre a mudança de cor da amostra digerida para verde ou azul claro e transparente ou límpido (a tonalidade azul ou verde dependerá do catalizador utilizado). Após a mudança de cor é necessário aguardar 30 a 40 minutos, para reação se completar.

Figura 1. (A) Digestão de uma amostra para a determinação de nitrogênio total. (B) Mudança de coloração da solução durante o processo da digestão. Extraído de Embrapa, 2016.

 

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Referências

AOAC: Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists: Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL, 21st Edition (2019).

IAL, Instituto Adolfo Lutz. Métodos físico-químicos para análise de alimentos. São Paulo: Instituto Adolfo Lutz, p. 1020, 2008.

International organization for standardization. Milk — Determination of nitrogen content — Part 3: Block-digestion method (Semi-micro rapid routine method). ISO 8968-3:2004 [IDF 20-3:2004]. Geneva,2004.

GALVANI, F.; GAERTNER, E. Adequação da metodologia Kjeldahl para determinação de nitrogênio total e proteína bruta. Circular Técnica, Nº63. Corumbá: Embrapa Pantanal, 2006. p9. Disponível em: https://www.infoteca.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/812198/1/CT63.pdf