La destilación se encarga de transformar la forma del nitrógeno, permitiendo su cuantificación en el paso posterior, que es la titulación. Una serie de detalles aseguran que la destilación se realice correctamente, influyendo en los resultados finales.

La destilación es el segundo paso del análisis de proteínas por el método Kjeldahl y tiene lugar después de que la muestra ha sido digerida. Vea más sobre las 8 dudas clásicas sobre la digestión en el análisis de proteína. 

El método de determinación de nitrógeno total fue desarrollado hace más de 130 años por el químico danés Johan Gustav Kjeldahl y desde entonces ha sido estudiado, modificado y mejorado. El método Kjeldahl es una referencia o estándar para cuantificar el contenido de proteína en los alimentos, siendo recomendado por organismos normalizadores como AOAC e ISO. Este método cuantifica el contenido de nitrógeno total y estima indirectamente el contenido de proteína de los alimentos.

Método Kjeldahl

El método consiste en una digestión con ácido sulfúrico concentrado y una mezcla catalítica para acelerar la reacción, seguida de una destilación con hidróxido de sodio para liberar el ion amonio que se encuentra retenido (generalmente) en el ácido bórico.

El último paso es la titulación con ácido fuerte estandarizada para cuantificar el nitrógeno total presente en la muestra. Luego, el contenido de proteína se estima indirectamente a través del cálculo multiplicando el contenido de nitrógeno por un factor de conversión.

El resultado final del análisis, es decir, el contenido de proteínas, depende de la calidad de cada paso del proceso analítico. Por poseer varias etapas, todos los detalles del proceso se deben realizar de forma criteriosa com el objetivo de evitar errores.

Destilación

En la destilação el objetivo es transformar el nitrógeno presente en la solución en forma de (NH₄)₂SO₄ (Sulfato de amonio, estable en medio líquido) para NH₄OH (Hidróxido de amonio, volátil). Con adición de Hidróxido de sodio (NaOH) concentrado, y con el calentamiento, ocurre la liberación del íon amonio que se separa de la mezcla por destilación. El NH₄ liberado queda atrapado en una solución de Ácido bórico, formando borato de amonio, que luego se titula con ácido estandarizado para calcular el contenido de nitrógeno.

En resumen, el tubo de borosilicato que contiene la muestra digerida se coloca en un Destilador de nitrógeno, modelo TE-0364, TE-0365/1 o TE-0366, donde se dosifica hidróxido de sodio para su neutralización. El sulfato de amonio, presente en el tubo, en contacto con el hidróxido de sodio y el vapor de agua de la caldera del equipo, se transforma en hidróxido de amonio y, por lo tanto, se libera en estado gaseoso.

Cuando se libera el hidróxido de amonio, pasa por el sistema de destilación del equipo y se condensa dentro del Erlenmeyer que previamente fue preparado con ácido bórico e indicador, formando borato de amonio en un color que cambia de rojo pálido a verde o azul, dependiendo del indicador utilizado.

ü    Antes de iniciar la destilación

-      La solución digerida debe enfriarse a temperatura ambiente.

-      Es necesario colocar un Erlenmeyer que contenga ácido bórico e indicador en la salida del condensador, de manera que la punta del condensador quede sumergida en la solución dentro del erlenmeyer

ü    ¿Cuánto y por qué se agrega agua a la solución antes de la destilación?

La dilución en agua atenúa las reacciones violentas durante la alcalinización con Hidróxido de Sodio. Así, con la ayuda de una lavadora, se añade agua destilada para lavar las paredes del tubo que contiene la muestra. En los destiladores más tradicionales (que no funcionan con caldera generadora de vapor), el agua también sirve para favorecer la ebullición, función que ya no tiene sentido en los destiladores con caldera generadora de vapor.

La cantidad de agua añadida es relativamente pequeña y hay que tener en cuenta el volumen del tubo disponible. Si se agrega agua en exceso, mayor que la capacidad útil del tubo, la muestra puede ascender a las esferas Kjeldahl durante la destilación.

ü    ¿Cuál es el volumen de hidróxido de sodio?

Este volumen depende de cuán acidificada esté la solución y debe ser suficiente para su neutralización y para completar la reacción que transforma el sulfato de amonio en hidróxido de amonio. Por lo tanto, a veces se usa un indicador ácido-base, como la fenolftaleína, para ayudar a definir el volumen correcto que se debe agregar.

Previo al hidróxido de sodio, se agrega a la muestra 1 mL de solución de Fenolftaleína al 1%. El hidróxido de sodio se agrega lentamente hasta que se ve un cambio de color de la solución.

ü    ¿Cuál es el volumen de solución para iniciar la destilación?

El volumen depende de la capacidad del tubo utilizado y del protocolo seguido. Si el volumen de la solución es mayor que su capacidad, la solución puede ascender a las esferas Kjeldahl durante la destilación.

Los volúmenes recomendados para la destilación son de hasta 30 mL en el tubo micro y hasta 150 mL en el tubo macro.

ü    ¿Cuál es el volumen recolectado después de la destilación?

El volumen de destilado recolectado debe estar estandarizado para todas las muestras de acuerdo con el protocolo seguido.

Si el tiempo de destilación es mayor, el volumen recogido será mayor, ya que se transportará un mayor volumen de agua a la solución receptora. Sin embargo, el exceso de agua no cambiará los resultados de la etapa posterior, que es la titulación.

La mayor parte del NH₃ destilado se retiene en la solución aceptora de ácido dentro de los 5 a 10 minutos del tiempo de ebullición. Sin embargo, según el volumen de la mezcla de digestión y el método que se siga, se deben recolectar de 15 a 150 mL de condensado en el frasco receptor para asegurar la recuperación completa del nitrógeno.

ü    Tasa de destilación

La tasa de destilación se ve afectada por la capacidad de enfriamiento del condensador y la temperatura del agua de enfriamiento, pero principalmente por la entrada de calor.

Una velocidad de destilación de aproximadamente 7,5 mL/minuto es la más comúnmente citada en los métodos aceptados.

ü    Muestras con bajo contenido de nitrógeno

Para muestras con bajo contenido de nitrógeno, además del mayor volumen de muestra, se recomienda “pre-acondicionar” el destilador de nitrógeno antes de su uso.

Para eso, se requiere destilar una mezcla 1:1 de agua sin amoníaco y NaOH (hidróxido de sodio) al 50 % durante 5 minutos antes de la destilación de la muestra para reducir la contaminación atmosférica por amoníaco.

ü    ¿Por qué es importante el enfriamiento del condensador?

El enfriamiento del condensador es fundamental para la destilación, además de garantizar que se forme Tetraborato de Amonio y que no haya pérdida de amoníaco por evaporación que interfiera en el resultado final.

El baño termostatizado se puede utilizar para asegurar el enfriamiento de los condensadores; además, su uso reduce el consumo de agua, ya que es un sistema de circulación cerrada. Para los destiladores de nitrógeno, modelo TE-0364 y TE-0365/1, pueden ser utilizados los baños termostatizados modelo TE-183 y TE-184/1. Para el destilador de nitrógeno, modelo TE-0364, también se puede utilizar el TE-2005/1.

ü    Finalizando la destilación

Al final de la digestión, antes de apagar el destilador, se debe retirar el  Erlenmeyer (ubicado en la punta del condensador), para que no haya retorno de la solución destilada al equipo.

Además, entre una muestra y otra, es necesario lavar la punta del destilador con agua destilada.

Consideraciones finales

El método Kjeldahl es el más utilizado para el análisis de proteínas en alimentos, sin embargo, la ocurrencia de errores acumulativos en los diferentes pasos analíticos (muestreo, digestión, destilación y titulación) puede comprometer la precisión y exactitud del resultado final.

Además de los equipos adecuados y la definición del método a seguir, es necesario que los analistas estén capacitados para establecer y realizar el protocolo, asegurando que el proceso de análisis se lleve a cabo con éxito.

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