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8 preguntas clásicas sobre la digestión en el análisis de proteínas

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La digestión es el primer paso del análisis de proteínas por el método Kjeldahl y ocurre después del muestréo y preparación de la muestra.

 

El método de determinación de nitrógeno total fue desarrollado hace más de 130 años por el danés Johan Gustav Kjeldahl y desde entonces ha sido estudiado, modificado y mejorado. El método Kjeldahl es una referencia o estándar para cuantificar el contenido proteico en los alimentos, siendo recomendado por organismos estandarizadores como AOAC e ISO. Este método cuantifica el contenido total de nitrógeno y estima indirectamente el contenido proteico de los alimentos.

 

 

Método Kjeldahl

El método consiste en una digestión con ácido sulfúrico concentrado y una mezcla catalítica para acelerar la reacción, seguida de una destilación con hidróxido de sodio para liberar el ion amonio que se encuentra retenido en el ácido bórico.

 

El último paso es la titulación con ácido fuerte estandarizada para cuantificar el nitrógeno total presente en la muestra. Luego, el contenido de proteína se estima indirectamente a través del cálculo multiplicando el contenido de nitrógeno por un factor de conversión.

 

El resultado final del análisis, es decir, el contenido de proteínas, depende de la calidad de cada paso del proceso analítico.

 

Digestión

La digestión se basa en calentar la muestra con ácido sulfúrico hasta la oxidación de los compuestos orgánicos. El nitrógeno de la muestra (orgánico) se reduce y se transforma en sulfato de amonio (inorgánico) que es una sustancia estable. En este paso se utiliza una mezcla catalítica con el fin de elevar la temperatura de ebullición del ácido y aumentar la tasa de oxidación de la materia orgánica, acortando el tiempo requerido para la digestión.

 

La temperatura de ebullición del ácido sulfúrico concentrado es de cerca de 330°C, y con la adición de una sal como el sulfato de potasio (K2SO4), por ejemplo, la temperatura de la solución de digestión puede elevarse a 390°C o más, dependiendo de la proporción de sal a ácido.

 

Durante la digestión, el carbono se transforma en dióxido de carbono (CO2) y el hidrógeno en agua (H2O). Además, el nitrógeno que existe en forma de amina, amida y nitrilo se transforma en amoníaco (NH3) que reacciona con H2SO4 y forma sulfato de amonio ((NH4)2SO4) durante la digestión, como se muestra en las reacciones a continuación, y al enfriarse, puede formar cristales (GALVANI, GAERTNER, 2006). 

 

Aunque todos los pasos son críticos para el resultado final del análisis, la digestión es uno de los que más dudas genera sobre su ejecución. Con el objetivo de facilitar y resolver dudas, hemos elaborado un listado de las preguntas más frecuentes.

 

1)     ¿Es necesario llevar a cabo la digestión en una campana de extracción de gases?

Sí, el bloque debe instalarse dentro de la campana. La función principal de la campana de extracción es expulsar vapores y gases y actuar como una barrera física, ofreciendo protección a los usuarios contra derrames de solución, vidriería rota, manipulación de reactivos y otros problemas que pueden ocurrir durante la digestión ácida.

 

2)     ¿Es necesario el uso del Scrubber seco, modelo TE-154/1, aún cuando la digestión se realiza en el interior de la campana de extracción de gases?

De acuerdo a la respuesta anterior, la campana es la encargada de evacuar los vapores y gases tóxicos; sin embargo, solo la campana, sin la presencia de un sistema complementario, no realiza ningún tipo de neutralización o tratamiento de gases tóxicos.

El Scrubber seco garantiza el correcto tratamiento de los gases y vapores liberados a la atmósfera, contribuyendo a una mayor protección del medio ambiente, al minimizar los impactos negativos.

 

3)     ¿Qué volumen de tubo usar?

El método suele clasificarse en macro, semi-micro o semi-macro y micro, según la cantidad de muestra sometida a digestión para su análisis. Los parámetros que difieren entre sí son: masa de la muestra (que va desde miligramos a gramos o mL), volumen de ácido sulfúrico, tamaño de la vidriería utilizada y equipos de digestión.

 

Si bien la clasificación del método dependerá de la norma o directriz adoptada, es posible considerar la siguiente definición en relación com el tamaño de la vidriería:

 

 

·       Micro:  tubos com una capacidad TOTAL hasta 100mL, equivalente al Bloque de digestión micro con rampas y niveles, modelo TE-041/25, no recomendado para muestras líquidas. 

       Semi Micro o Semi Macro:  tubos con capacidad TOTAL de aproximadamente 400 mL, equivalente al Bloque de digestión macro con touch screen, modelo TE-0081/50. Puede ser utilizado para muestras líquidas y sólidas. 

       Macro: digestor tradicional de la técnica desarrollada por Johan Gustav Kjeldahl, compuesto por matraces de capacidad TOTAL entre 500 mL y 800 mL. Se puede utilizar para muestras líquidas y sólidas.

 

El factor determinante en la elección del método Kjeldahl es el contenido de nitrógeno en la muestra. Además, el estado físico de la muestra (líquido o sólido) también influye en la elección del protocolo. Cabe señalar que la cantidad de muestra a ser analizada depende del contenido de nitrógeno esperado y del grado de homogeneidad del material.

 

Cuanto mayor sea el contenido de nitrógeno de la muestra, menor será la masa de muestra requerida y, en consecuencia, menor será el tamaño del tubo. A continuación se ofrece una sugerencia para elegir el método o el tamaño del bloque/tubo de digestión:


*muestra + reactivos

 

 

4)     ¿Cómo calcular la masa correcta de la muestra?

El contenido ideal de nitrógeno oscila entre 1 y 200 mg de nitrógeno por tubo de ensayo de vidrio.

El límite de determinación es de 0,02 mg de nitrógeno por tubo de ensayo. Con base em estos datos, se puede calcular la masa de muestra correcta que se va a digerir.

 

5)     ¿Cuál es la temperatura de calentamiento para la digestión?

La temperatura ideal para la digestión se define según el tipo de muestra y el protocolo adoptado. No obstante, se recomienda que no supere los 430°C. Un rango de 370 °C a 400 °C suele ser adecuado para diferentes tipos de alimentos.

 

A temperaturas superiores a 390°C, la formación de nitrógeno gaseoso (N2) se convierte en una posibilidad, ya que favorece la pérdida de nitrógeno por pirólisis. Tal condición puede afectar la precisión del resultado final, al reducir el contenido de nitrógeno en la muestra.

 

La pérdida de nitrógeno por volatilización es una de las razones por las que el calentamiento es gradual y no repentino.

 

Al comienzo de la digestión, la reacción puede ser un poco lenta, esperándose una temperatura más alta al final del proceso de digestión, debido al consumo gradual del ácido. Sin embargo, factores como la entrada de calor, el consumo de ácido por parte de la materia orgánica y la vaporización, la relación sal/ácido, el tiempo de digestión y el tipo de frasco Kjeldahl están interrelacionados e influyen en la temperatura final de la solución.

 

6)     ¿Volumen de ácido sulfúrico utilizado?

La cantidad de ácido necesaria está influenciada por el tamaño de la muestra y la cantidad relativa de carbono e hidrógeno en la muestra, así como la cantidad de nitrógeno. Además, una muestra muy rica en grasas consume una mayor cantidad de ácido.

 

Por lo tanto, la cantidad de ácido a añadir inicialmente debe ser suficiente para la digestión de la muestra sin estos interferentes y debe incrementarse a medida que aumenta la masa de muestra y/o los interferentes.

 

Vale la pena señalar que los incrementos en el volumen de ácido están previstos en los protocolos, ya que ya han sido validados para los tipos de muestras a los que están destinados.

 

7)     ¿Cuál es la proporción ideal de ácido sulfúrico y catalizador?

La relación entre el ácido sulfúrico y las sales de sulfato es crucial para que se alcance la temperatura de ebullición. La proporción ideal de ácido sulfúrico y catalizador es de aproximadamente 2 mL de H2SO4 por 1 g de catalizador.

 

8)     ¿Cuándo termina la digestión?

El proceso de digestión se completa cuando el color de la muestra digerida cambia a verde o azul claro y transparente o claro (el tono azul o verde dependerá del catalizador utilizado). Después del cambio de color, es necesario esperar de 30 a 40 minutos para que se complete la reacción.

 

Figura 1. (A) Digestión de una muestra para la determinación del nitrógeno total. (B) Cambio de color de la solución durante el proceso de digestión. Tomado de Embrapa, 2016.

 

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Referencias

AOAC: Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists: Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL, 21st Edition (2019).

IAL, Instituto Adolfo Lutz. Métodos físico-químicos para análise de alimentos. São Paulo: Instituto Adolfo Lutz, p. 1020, 2008.

International organization for standardization. Milk — Determination of nitrogen content — Part 3: Block-digestion method (Semi-micro rapid routine method). ISO 8968-3:2004 [IDF 20-3:2004]. Geneva,2004.

GALVANI, F.; GAERTNER, E. Adequação da metodologia Kjeldahl para determinação de nitrogênio total e proteína bruta. Circular Técnica, Nº63. Corumbá: Embrapa Pantanal, 2006. p9. Disponible en: https://www.infoteca.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/812198/1/CT63.pdf