Considerado el paso más crítico y decisivo para el resultado final del análisis, el muestreo comprende desde la recolección y preparación de la muestra para el análisis, siendo de extrema importancia para la determinación de proteína.

El método de determinación de nitrógeno total fue desarrollado hace más de 130 años por el danés Johan Gustav Kjeldahl y desde entonces ha sido estudiado, modificado y mejorado.

Aunque es difícil definir un procedimiento común aplicable a todas las matrices alimentarias, el método Kjeldahl es una referencia o estándar para cuantificar el contenido proteico en los alimentos, siendo recomendado por organismos normalizadores como AOAC e ISO. Este método cuantifica el contenido total de nitrógeno y estima indirectamente el contenido proteico de los alimentos.

Etapas del método Kjeldahl

El método consiste en la digestión con ácido sulfúrico concentrado y mezcla catalítica para acelerar la reacción, seguida de una destilación en caliente con hidróxido de sodio para liberar el ion amonio que se encuentra retenido en el ácido bórico.

El último paso es la titulación con ácido estándar para cuantificar el nitrógeno total presente en la muestra. Luego, el contenido de proteína se estima indirectamente a través del cálculo multiplicando el contenido de nitrógeno por un factor de conversión.

El resultado final del análisis, es decir, el contenido de proteínas, depende de la calidad de cada paso del proceso analítico. Los diversos pasos del análisis pueden ser fuentes de error, incluido el muestreo.

Muestreo X Muestra

El muestreo es el primer paso para realizar un análisis. Pero, ¿cuál es la diferencia entre muestra y muestreo?

Una muestra es una pequeña porción de un producto o materia prima seleccionada para representar el todo.

El muestreo corresponde a la extracción de cantidades moduladas de material de un conjunto a muestrear, para la composición de la muestra primaria o global, de tal forma que sea representativa del conjunto muestreado.

Muestreo

El muestreo es la serie sucesiva de pasos operativos específicos para asegurar que la muestra se obtiene con la necesaria condición de representatividad.

En resumen, el muestreo consta de tres pasos principales:

• Toma de muestra bruta
• Obtención de la muestra de laboratorio
• Reparación de muestras para análisis

La muestra bruta debe ser una réplica, en tamaño reducido, del total muestreado, tanto en composición como en tamaño de partícula.

Cuando la muestra es homogénea, como por ejemplo un líquido, el proceso de muestreo es simple, donde cualquier fracción refleja la composición promedio del conjunto. Si el material es heterogéneo, es decir, una mezcla sólida, es necesario combinar varias porciones para garantizar que la muestra sin procesar sea representativa.

Además de la colecta, se debe realizar la recepción y el almacenamiento de las muestras para asegurar su estabilidad, evitando posibles deterioros y alteraciones de la composición de las muestras.

Después de la recolección, los alimentos secos, polvos o gránulos se pueden homogeneizar a través del agitador homogeneizador en forma de Y con un volumen de 5 (TE-201/5) y 10 (TE-201/10) litros o en el agitador homogeneizador en V con volumen de 5 (TE-200-05) y 15 (TE-200-15) litros. 

Después de la homogeneización, la muestra bruta o primaria se reduce para obtener la muestra de laboratorio. Para alimentos secos, la reducción o división se puede realizar utilizando un separador de muestras tipo Jones, modelo R-TE-064 o R-TE-066.

 La muestra de laboratorio es el resultado de la reducción de la muestra bruta mediante operaciones realizadas para garantizar la continuidad de la condición de representatividad de la muestra.  

La muestra para análisis es una porción menor de la muestra de laboratorio, suficientemente homogeneizada, con masa y granulometría adecuadas para la realización de la prueba analítica. Se puede obtener a través de operaciones que involucran métodos predominantemente físicos, como secado, molienda, tamizado, entre otros, dependiendo del tipo de muestra.

Los pasos requeridos en la preparación de muestras para el análisis de proteínas por el método Kjeldahl dependen de las características físicas y químicas de la muestra.

Masa de la muestra X Homogeneidad

La masa de muestra requerida para el análisis depende de su grado de homogeneidad. En general, los resultados exactos para muestras no homogéneas no se pueden obtener utilizando pequeñas cantidades de muestra.

Entre menor sea la masa de la muestra utilizada en el análisis, mayor deberá ser su grado de homogeneidad.

Para muestras homogéneas, se debe pesar la masa de la muestra para obtener un volumen de titulación final adecuado, alrededor de 10 - 20 mL. La muestra analítica debe contener preferiblemente 30 - 140 mg de nitrógeno (MOORE et al., 2010).

El grado de homogeneidad de la muestra es un factor determinante del tamaño de la muestra, que depende, por ejemplo, de los pasos de molienda y homogeneización.

Secado de la muestra

Las muestras húmedas deben secarse previamente para evitar la interferencia de la humedad en la reacción de digestión. Para el secado de muestras se puede utilizar la estufa con circulación y renovación de aire, modelo TE-394/2-MP.

Si el análisis se realiza sobre una muestra húmeda, es necesario realizar la determinación de humedad simultáneamente, de manera que el contenido de humedad se considere al momento de cuantificar el contenido de N en base seca, con el fin de obtener una mayor precisión en el contenido de proteína.

La humedad se puede determinar por el método gravimétrico usando una balanza analítica, desecador de vacío, modelo TE-3950 o TE-3950/1, bomba de vacío, modelo TE-0581 y estufa con circulación y renovación de aire, modelo TE-394/2-MP.

Reducción del tamaño de partícula

La reducción del tamaño de partícula aumenta el área superficial de la muestra, facilitando el proceso de digestión. La molienda es el principal procedimiento para fragmentar partículas sólidas, y el tipo de molino se define de acuerdo al tipo de muestra.

Suponiendo que todos los pasos se realicen correctamente, se obtendrán mejores resultados cuanto menor sea el tamaño de partícula.

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Granos, cereales y raciones

Las muestras de granos, cereales y raciones se pueden moler hasta obtener un polvo fino, con un tamaño de partícula inferior a 1 mm o malla 20 o de acuerdo con las normas que se sigan. Para la reducción del tamaño de las partículas se utilizan molinos, cuyo modelo se define de acuerdo a las características de la muestra.

- Molino Multiuso, modelo TE-631/4

- Molino de rotor, modelo R-TE-651/2

- Molino Tecmill, modelo R-TE-633

Debido al alto contenido de aceite en algunas muestras, la molienda puede resultar difícil. Para ello, se recomienda utilizar el molino multiuso, modelo TE-631/4, el cual posee una tina con sistema de enfriamiento, permitiendo su uso en conjunto con un baño termostático, modelo TE-2005, para evitar el calentamiento de la muestra.

ü  Carnes y pescados

Para la carne y el pescado, es necesario eliminar los componentes no comestibles, como restos de piel o cuero, huesos, músculo oscuro y sangre. Luego, la muestra se puede moler en un multiprocesador.

Teniendo en cuenta que el material tiene poca homogeneidad, es necesario un tamaño mayor de muestra, para que todos los componentes de la muestra sean incluidos y representativos.

Si la muestra no se analiza inmediatamente, debe almacenarse a una temperatura de 4 °C por un período de hasta 24 horas. El almacenamiento se puede hacer en una Incubadora, modelo TE-371/240L ou Mini incubadora para BOD, modelo TE-381/1.

Consideraciones finales

El muestreo es considerado el paso más crítico y decisivo para la precisión y exactitud del método, exigiendo más tiempo y esfuerzo por parte del analista en la selección de procedimientos rápidos, sencillos y eficientes.

Si no se realiza correctamente, los resultados no se corresponderán con la composición del material bajo análisis. De esta forma, no se corregirán ni compensarán los errores cometidos durante el muestreo, por muy cuidadosos que sean los análisis en el laboratorio.

En la rutina del laboratorio, las fuentes de errores necesitan ser identificadas, minimizadas y/o controladas en cada etapa del análisis, a través de acciones correctivas y preventivas y también a través de la adopción de buenas prácticas de laboratorio.

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Referencias

MOORE, J. C. Total protein methods and their potential utility to reduce the risk of food protein adulteration. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, v. 9, 2010, p. 330 - 357.

Argandoña, E. J. S. et al. Roteiro de aulas práticas da disciplina de análise de alimentos. Dourados, MS: Ed. UFGD, 2017. (Coleção Cadernos Acadêmicos).