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Bacillus thuringiensis e sua contribuição para uma agricultura mais sustentável

biorreator

HISTÓRIA

Bacillus thuringiensis é uma espécie de bactéria entomopatogênica que se encontra em solos de todos os continentes. Esta bactéria foi inicialmente descoberta pelo biólogo japonês Ishiwata Shigetane em 1902 como um agente causador de doenças em bichos da seda. Porém em 1911, esta bactéria foi redescoberta pelo cientista Ernst Berliner, que durante suas pesquisas isolou a causa de doenças em larvas no solo do estado de Turíngia na Alemanha.

Originalmente se pensava que esta bactéria era um risco para animais como o bicho da seda, porém hoje são consideradas como ‘’coração’’ do controle microbiano de insetos, correspondendo à mais de 90% dos inseticidas presentes no mercado. Devido ao seu poder inseticida, Bt vem sendo usada como tal desde 1938 na França, e nos Estados Unidos a partir da década de 50.

Berliner notou que as bactérias produziam proteínas cristalizadas com efeito inseticida, ocasionando morte celular no trato digestivo do inseto. Estas proteínas têm sido usadas em sprays inseticidas desde a década de 30 para controlar insetos na agricultura.

Devido ao efeito tóxico aos insetos, cientistas identificaram e isolaram o DNA da Bacillus thuringiensis (Bt) por meio da biotecnologia e o introduziram em culturas como soja, cana de açúcar, milho e algodão, tornando-as resistentes à insetos como lagartas da soja, broca da cana e besouros.

 

APLICAÇÃO E CARACTERÍSTICAS

Bactérias e outros microrganismos são responsáveis pela decomposição de matéria orgânica, solubilização e mineralização de nutrientes, assim como são responsáveis pela liberação de compostos orgânicos como enzimas, ácidos, antibióticos, metabólitos e vitaminas.

Bacillus thuringiensis é uma bactéria gram-positiva, aeróbia não estrita,  com faixa de temperatura de crescimento entre 10° e 45°. Tem como característica principal, a formação de inclusões proteicas cristalinas durante a fase de esporulação. Estas inclusões contém uma série de proteínas com função inseticida como as α-exotoxinas, β-exotoxinas, δ-endotoxinas (proteínas Cry e Cyt) e proteínas inseticidas vegetativas (VIP), que são produzidas e secretadas durante a fase vegetativa de crescimento das bactérias.  A função inseticida das Bt é devido à presença dos cristais denominados delta-endotoxinas ou proteínas Cry. Estas proteínas são responsáveis pela atividade entomopatogênica nos insetos alvos, sendo eficaz em diferentes ordens de insetos como Lepidoptera e Coleoptera.

Estas proteínas que tem a forma de cristais, quando ingeridas pelas larvas dos insetos, são solubilizadas no intestino devido ao pH alcalino, e com isso liberam pró-toxinas que são clivadas por proteases, tornando-se toxinas ativas.  Fisher (2014) reporta que tais toxinas agem paralisando o aparelho digestor das larvas e posteriormente, levam à  morte por inanição e paralisia geral dos músculos.

O efeito tóxico das proteínas começa logo após sua ingestão, dentre os sintomas está a perda de apetite do inseto e o abandono do alimento, seguida por paralisia do intestino e posterior morte. As larvas mortas com intoxicação provocadas por Bt, apresentam a cor negra característica desta infecção.


PRODUÇÃO DE INSETICIDAS BT

A demanda por produtos de origem biológica vem crescendo por ser uma alternativa viável e segura, entretanto sua produção e uso deve seguir critérios de segurança e qualidade, sendo essencial o uso de equipamentos e técnicas de manipulação que garanta segurança para o usuário e meio ambiente.


Para a produção de produtos biológicos, é essencial ter uma estrutura física adequada, equipamentos e insumos de boa qualidade. As principais etapas para produção consistem em: bioprospecção, estocagem dos microrganismos, processo fermentativo, recuperação dos princípios ativos de interesse (proteínas, esporos), formulação do produto e controle de qualidade.

Após a seleção das cepas a serem utilizadas, a multiplicação se dará através de processo fermentativo em biorreatores, composto de seus atuadores como: controle de pH através da adição de ácido e base, temperatura, adição de nutrientes, controle e monitoramento do oxigênio dissolvido, entre outros.

Além do uso de biorreatores, também é necessário o uso de uma caldeira geradora de vapor ou autoclave, que faz a esterilização do meio de cultivo, assim como a esterilização de todas as entradas de sensores e outros acessórios, um compressor de ar, sistema de resfriamento e outro equipamento que fará a separação/ filtração dos compostos de interesse para produção do produto final.

A forma mais comum e eficiente para produção de produtos compostos de Bt se dá através de processos fermentativos submersos em biorreatores. A fermentação acontecerá em um vaso ou dorna de reação, contendo o meio de cultura líquido mais apropriado para a espécie.

 

CULTIVO EM BIORREATORES

Os meios de cultivo geralmente possuem uma fonte de carbono (glicose, amido e dextrose), uma de nitrogênio ( peptona, extrato de caseína) e sais minerais (cálcio, manganês, zinco e magnésio), sendo necessário às vezes a adição de antiespumante.

A fonte de carbono, que tem como função fornecer energia, pode ser oriunda de resíduos industriais como melaço de cana, água de maceração de milho.

A fonte de nitrogênio tem como função a síntese de proteínas e ácidos nucleicos, e os sais minerais agem como co-fatores e regulam o estresse osmótico na célula.

Após a seleção do meio de cultura e seus componentes, este deve ser colocado no biorreator e a checagem e calibração dos sensores de pH, temperatura, O2 e antiespumante devem ocorrer. Após o ajuste dos parâmetros, deve-se adicionar a cepa escolhida com aproximadamente 2% do volume do meio a ser inoculado, sendo necessário manter os parâmetros de controle dentro da escala ótima para crescimento da Bt.

A faixa de pH do meio de cultura para Bacillus t. está entre 6.8 e 7.8  não sendo aconselhável passar de valores acima de 8.5, o que pode levar à solubilização das endotoxinas.  A temperatura a ser mantida deve estar entre 28 e 32°. Outro parâmetro que requer atenção é o oxigênio dissolvido, que deve ser mantido em torno de 40% sem atingir valores inferiores a 20%, isto porque à medida que o processo fermentativo avança, a exigência de OD aumenta.

O tempo de fermentação pode durar entre 24 e 72 horas, dependendo das condições de cultivo. A fermentação ocorre em biorreatores de bancada que variam entre 1,5 litros e 15 litros, e biorreatores piloto que variam entre 25 litros até mais de 10 mil litros, sempre com controle e monitoramento dos parâmetros como temperatura, pH e aeração.

Ao final da fermentação, o caldo fermentado passa por filtração e recuperação dos esporos e toxinas em uma coluna de micro/ultra filtração, sendo um dos métodos mais utilizados para tal função. Após essa filtração e recuperação dos metabólitos de interesse, ocorre a formulação do produto que tem como objetivo entregar um produto estável durante a aplicação e estocagem, assim como proteger os microrganismos e cristais das condições adversas ambientais.

Antes da comercialização do produto, é realizada a análise de qualidade que o produto apresenta, principalmente sua toxicidade, sendo analisada através de bioensaio com o inseto alvo. Estes testes são essenciais para garantir segurança do usuário e do meio ambiente. Nos Estados Unidos estes testes são regulamentados pela Agência de Proteção Ambiental (US EPA) e departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA), sendo no Brasil regulamentado pela Anvisa.

Apesar de biopesticidas e outros produtos de origem biológica poder controlar vários tipos de doenças e pragas, sendo cada ingrediente ativo específico para o alvo pretendido, esta prática não substitui completamente o uso de químicos sintéticos, pois o uso integrado de ambos contribui para o crescimento da agricultura.

 Preparamos um Guia exclusivo de biorreatores com informações que podem te ajudar na escolha do modelo ideal.


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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ÂNGELO, E. A.; VILAS_BÔAS, G. T.; CASTRO-GÓMEZ, R. J. H. Bacillus thuringiensis: características gerais e fermentação.Londrina:Semina: Ciências Agrárias, v.31, n.4, p.945-958, out./dez. 2010.

BOBROWSKI, V. L.; FIUZA, L. M.; PASQUALI, G.; BODANESEZANETTINI. Genes de Bacillus thuringiensis: uma estratégia para conferir resistência a insetos em plantas. Santa Maria:Ciência Rural, , v.34,n1,p.843-850, setout, 2003.

FISCHER, T. D. Avaliação do inseticida biológico (Bacillus thuringiensis) no manejo de pragas em cultivares de soja (Glycine Max L.) modificadas geneticamente. Ijuí:Universidade Regional do Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul, 2014.

GUSMÃO, F. P. Bioinseticida à base de Bacillus thuringiensis.Lorena:Monografia apresentada à Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo, como requisito para a conclusão do curso de graduação de Engenharia Bioquímica, 2013.